高通量測序結果全方位驗證策略
2017.12.13? 陜西博瑞德生物科技有限公司
二代測序結果已出,差異基因一目了然,但是如何通過(guò)實(shí)驗的方法對數據進(jìn)一步驗證是很多老師們手足無(wú)措的事情,今天,就為大家介紹下常用的二代測序驗證方法。
1?定性定量實(shí)驗方案
1.1?實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)作為最常見(jiàn)的二代測序驗證方法,廣泛應用于二代測序結果的定性定量研究。轉錄組測序基于生物信息分析計算出的多基因表達量會(huì )存在一定誤差,而qPCR可檢測特定基因的表達豐度,特異性更高。
1.2 Northern-blot
首先通過(guò)電泳的方法將不同的RNA分子依據其分子量大小加以區分,然后通過(guò)與特定基因互補配對的探針雜交來(lái)檢測目的片段。步驟如下:
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2?功能驗證實(shí)驗方案
2.1?構建過(guò)表達株系
DNA片段被轉入特定生物中,與其本身的基因組進(jìn)行重組,再從重組體中進(jìn)行數代的人工選育,從而獲得具有穩定表現特定的遺傳性狀的個(gè)體。步驟如下:
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2.2?小干擾RNA(siRNA)株系
siRNA可經(jīng)過(guò)多種不同轉染(transfection)技術(shù)導入細胞內,并對特定基因產(chǎn)生具專(zhuān)一性的敲降(knockdown)效果。步驟如下:
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